外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)是ELISpot和FluoroSpot 分析中最-常-用的細胞。PBMCs主要包括兩大類細胞，淋巴細胞（Lymphocyte）和單核細胞（Monocyte），其中淋巴細胞又包括T淋巴細胞，B淋巴細胞和NK細胞。高質(zhì)量的PBMCs是完成ELISpot和FluoroSpot檢測的基礎(chǔ)。具有多年ELISpot和FluoroSpot 檢測經(jīng)驗的Mabtech帶您詳細了解PBMCs分離、凍存和復蘇全過程，幫助您獲得高質(zhì)量的PBMCs。

一.PBMCs分離

對于全血采集，市場上有多種不同抗凝劑的血液采集管。根據(jù)Mabtech的經(jīng)驗，檸檬酸鹽和肝素抗凝劑的血液采集管最-適-合ELISpot。 如果需要大量細胞，PBMCs也可以從除去血漿和大部分紅細胞后獲得的白細胞濃縮物即白膜層中來制備。

材料：全血樣本、無菌Ficoll-Paque分離液、無菌PBS或無血清培養(yǎng)基(例如，RPMI 1640)、無菌15mL和50mL聚丙烯離心管、移液器、無菌巴斯德移液管、無菌吸頭、室溫離心機

注意：正式開始之前確保所有試劑都恢復到室溫，保證在無菌條件下操作。

步驟：

1.全血用PBS稀釋2倍(例如，10ml全血+ 10ml PBS)。如果樣本是血沉棕黃層，與全血相比，血沉棕黃層中的細胞密度更大，因此應該稀釋更多倍數(shù)(大約3倍)。

2.準備含有Ficoll-Paque分離液的離心管。根據(jù)血容量，可以使用15ml或50ml的離心管。如果使用15ml離心管，向離心管中加入5ml Ficoll-Paque。如果使用50ml離心管，則向離心管中加入15ml Ficoll-Paque分離液。

欣博盛常備可代替Ficoll-Paque分離液的Lymphoprep分離液，以及除了分離細胞外還可分離細胞器，病毒等的OptiPrep分離液。

3.輕輕地將稀釋的血液加入到Ficoll-Paque分離液的頂部，確保不要擾亂分離液的分層界面。對于15ml的離心管，加入8ml稀釋的血液，對于50ml的離心管，加入25ml稀釋的血液。請注意:加入稀釋的血液時可以傾斜試管，將血液樣本沿著離心管壁加入。

4.在室溫下以緩升緩降的方式用400 x g的速度離心30分鐘。

5.離心后，用巴斯德移液管小心收集在Ficoll-Paque分離液上層中的由單核細胞組成的白灰色層，并轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

6.以400 x g的速度離心10分鐘以清洗離心管中細胞。

7.倒掉上清液，重懸沉淀，并加入PBS或無血清培養(yǎng)基。請注意：重懸細胞時，首先輕敲試管，使細胞沉淀變得松散一些。然后加入1-2 ml緩沖液或培養(yǎng)基，輕柔上下吹打。

8.以400 x g的速度離心10分鐘清洗離心管中細胞。

9.倒掉上清液，重懸沉淀，并加入無血清培養(yǎng)基。

10.記錄體積，吸取小份進行細胞計數(shù)。

11.以400 x g的速度離心10分鐘以清洗離心管中細胞。

請注意：用Ficoll-Paque分離后，可能存在污染的紅細胞(RBC)和粒細胞。如有必要，可以用商業(yè)化紅細胞裂解液和粒細胞耗竭試劑清除。

12.如果需要立即使用這些細胞，則倒掉上清液，輕輕上下吹打，將細胞重懸在適當?shù)募毎囵B(yǎng)基中。PBMCs現(xiàn)在可用于基于細胞的免疫檢測，例如ELISpot、FluoroSpot 和流式細胞術(shù)。

如果您需要凍存細胞，請繼續(xù)參考第二個部分—PBMCs凍存

圖1. PBMCs分離示意圖

二、PBMCs凍存

材料：細胞凍存培養(yǎng)基:RPMI 1640(含2mM L-谷氨酰胺)+ 20% FCS和10% DMSO（如果您的細胞適應無血清培養(yǎng)基，請使用7% DMSO）；1.8ml細胞凍存管；無菌15mL和50mL聚丙烯離心管；凍存盒，例如“CoolCell"或“Mr. Frosty"；移液器；無菌吸頭；-80℃冰箱；液氮凍存罐。

請注意：操作之前請將凍存管標記好，并確保準備好凍存盒。室溫條件下細胞在凍存培養(yǎng)基中放置太久會影響細胞的活力。

步驟：

1.去除上清(上一節(jié)的步驟11 ),并在凍存培養(yǎng)基中將細胞稀釋至500萬至2500萬個細胞/ml的濃度。如果使用的是無血清冷凍培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度到100萬個細胞/ml。

2.在每個凍存管中加入等體積細胞懸液，例如每管加入1 ml，并將凍存管轉(zhuǎn)移到凍存盒中。

請注意：對于1.8ml凍存管，建議加入1ml細胞懸液。對于其他尺寸的凍存管，確保加入體積小于最大體積，因為液體在冷凍過程中會膨脹。

3.迅速將凍存盒放入-80℃的冰箱中，至少儲存4小時，最多儲存1周。

4.將凍存管從凍存盒轉(zhuǎn)移到-150℃冰箱或液氮罐中，長期保存。

圖2. PBMCs凍存示意圖

三．PBMCs復蘇

材料：細胞培養(yǎng)基:RPMI 1640(含2mM L-谷氨酰胺)+ 10% FCS，10 mM HEPES和100 μg/ml青霉素+ 100μg/ml鏈霉素；無菌15mL和50mL聚丙烯離心管；移液器；無菌吸頭；離心機；水浴鍋；細胞培養(yǎng)箱

步驟：

1.準備工作：將水浴鍋加熱至37 ℃ ，預熱細胞培養(yǎng)基，并將洗滌細胞步驟中使用的緩沖液恢復到室溫。

2.迅速將凍存管從液氮罐或冰箱轉(zhuǎn)移到37℃水浴鍋中，解凍細胞，直到只剩下一小塊冰晶。

請注意:如果您打算解凍多個凍存管，最好每次只解凍幾個。凍存培養(yǎng)基中含有對細胞有毒的DMSO，因此需要盡快進行下面步驟。

3.向凍存管中緩慢加入0.5-1 ml預熱的細胞培養(yǎng)基，在凍存管中重懸細胞并轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中。用1ml細胞培養(yǎng)基沖洗凍存管，并將其也轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。再補充合適體積的細胞培養(yǎng)基到離心管中。

4.以300 x g的速度離心10分鐘清洗細胞。

5.倒掉上清液，輕敲離心管，使沉淀變得松散。通過緩慢加入細胞培養(yǎng)基，將細胞重新懸浮在1 ml細胞培養(yǎng)基中。再加入細胞培養(yǎng)基至總體積15ml。

6.以300 x g的速度離心10分鐘清洗細胞。

7.倒掉上清液，將細胞重懸于1 ml細胞培養(yǎng)基中。再根據(jù)預期的細胞數(shù)量和所需的細胞濃度添加適量的細胞培養(yǎng)基。

8.將細胞靜置于細胞培養(yǎng)箱中一小時。將蓋子稍微擰松一些，便于氣體交換。

9.細胞靜置完成后，重新懸浮細胞，再靜置1分鐘讓聚集的細胞碎片沉淀。然后小心地將無碎片的細胞懸液轉(zhuǎn)移到一個新的15 ml離心管中。

請注意：每個15ml離心管中最多加入兩個凍存管(大約3000-4000萬個細胞)的細胞。

10.進行細胞計數(shù)并測定細胞活力。可以使用自動細胞計數(shù)器或使用臺盼藍染色顯微鏡觀察來進行計數(shù)。因為只有活細胞才能夠分泌靶標分析物，所以確保從細胞計數(shù)中排除死細胞和凋亡細胞。如果細胞濃度低于要求，再次離心細胞，重懸細胞并稀釋至所需體積。

圖3. PBMCs復蘇示意圖

溫馨提示：本文中的實驗步驟僅供參考，實驗時請按照產(chǎn)品說明書操作。

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