蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）保姆級教程

Part1：實驗方案

蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特點，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白。

我們的Western Blot實驗方案包含蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體、檢測（圖1）及所涉及的試劑，為您的WB實驗保駕護航。

圖1、Western Blot實驗步驟

● 蛋白提取

1、使用Trident Extraction Kits從樣本（細胞或組織）中提取蛋白。

（注：根據(jù)蛋白與抗體的具體情況優(yōu)化細胞數(shù)量以及上樣量）

2、蛋白濃度定量，在-20℃或更低溫度下冷凍保存。

3、在樣品中加入Trident Sample Buffer，100℃煮沸5mins，使蛋白質(zhì)變性；瞬時離心上樣。

（注：必要時，使用前在Trident Sample Buffer加入二硫蘇糖醇（DTT）或/3-巰基乙醇（2-ME））

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● SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜

1、將30 µg蛋白或 100 ng純化蛋白裝入SDS-PAGE凝膠孔中。

在SDS-PAGE凝膠孔中加入適量的Trident Blue Prestained Protein Ladder (GTX16376) 或 Trident Prestained Protein Ladder（高范圍：GTX50875 或標準范圍：GTX49384）裝入1個或多個額外的泳道中。

2、使用1x Running buffer以50-100 V的電壓運行1-2小時。建議將電壓調(diào)低并延長時間?？墒箺l帶更清晰，分辨率更高。

3、在Transfer buffer中將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或甲醇漂洗過的PVDF膜上。

（可選：在進行下一步之前，通過 Ponceau Red染色確認蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移成功）

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● 封閉、孵育抗體、洗膜

1. 封閉：在3%脫脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中封閉30-60分鐘。

2. 一抗孵育：將膜置于含適當稀釋一抗的1%脫脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中，在RT下孵育兩小時或在4°C下過夜。

3. 洗膜：1x PBST ，一次10分鐘，兩次5分鐘。

4. 二抗孵育：將膜置于含適當稀釋二抗的1%脫脂奶/PBST 或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中孵育1小時。

5. 洗膜：1x PBST ，三次，每次10分鐘。

（注：Trident Universal Protein Blocking Reagent不含任何動物血清，適用于WB、ELISA、IHC和ICC/IF實驗）

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● 基于ECL成像

按照Trident plus Western HRP Substrate（GTX400006）或Trident femto Western HRP Substrate（GTX14698）來檢測信號。

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